2019年10月（yuè）1日（rì），5-羟（qiǎng）甲基化胞嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿（niào）病研究领域（yù）取得重要进展。2型糖尿病（T2D）的血管并发症是导致2型糖尿病致（zhì）残致死的重（chóng）要（yào）病因，一（yī）直缺乏一种无创便捷（jié）的临床（chuáng）途径实现血管（guǎn）并发症的发生发展监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病（bìng）人的（de）整体生活质量，减少卫生经济负担。

该研究入组了62例2型糖尿（niào）病病（bìng）人，采（cǎi）用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观遗传标志物5hmC的（de）分布（bù）情况进行检（jiǎn）测，分（fèn）析5hmC标志物（wù）与2型糖尿病血管（guǎn）并发症发生发展（zhǎn）的相关性。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微血管事件具有（yǒu）相（xiàng）关（guān）性，主要涉及一（yī）些（xiē）与血管生物（wù）学（xué）和糖尿病（包括胰岛素耐受（shòu）和炎症反（fǎn）应）相关的基因和信号通路（lù）。该（gāi）研究建立的16个基因-5hmC标（biāo）志物组合检测可以准确区（qū）分（fèn）有并发症和无并发症的2型（xíng）糖尿病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传（chuán）统临床变（biàn）量例如白蛋白尿（niào）。除（chú）此（cǐ）之外，还建立了13个基因-5hmC标志物组合检测，可以进一步（bù）区（qū）分T2D合并（bìng）单一（yī）并发症（zhèng）和多种（zhǒng）并发症（zhèng）[实验（yàn）组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显（xiǎn）优于其他传统临床变量。该研究得出（chū）结（jié）论，5hmC标志物反映（yìng）了（le）T2D病人大血管/微血管并发症发生过程中的表观遗传（chuán）变化，因（yīn）而5hmC-Seal检测技术在监测糖尿病血管并发症发生和进展方面具（jù）有良好的临（lín）床应用（yòng）前景。

本研究共（gòng）纳入（rù）62例2型糖尿病病人（rén），包括没有（yǒu）血管（guǎn）并发症（zhèng）的病（bìng）人12例，有（yǒu）单一血管并发症（zhèng）的病人34例（24例发（fā）生大血管事件，10例发生微（wēi）血（xuè）管事件），以及有多种血（xuè）管（guǎn）并（bìng）发症的病人16例。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术（shù）捕获外周血cfDNA中（zhōng）的5hmC序列，进行二代（dài）测序，通（tōng）过生物信（xìn）息学（xué）分析找出（chū）并发症组与无并（bìng）发症组之（zhī）间（jiān）有显著（zhe）5hmC修饰差（chà）异的基（jī）因，单一（yī）并发症组和多种并发症组之间有显著5hmC修饰差异的基因（yīn）。随（suí）后利用回归模型对差异（yì）基（jī）因进一步筛选、优化，弹（dàn）性网络进（jìn）一步筛选，计算加权平均分，最（zuì）后得到一组具（jù）有高度灵敏度（dù）和特异性（xìng）的5hmC生物标（biāo）记物，并进一步在实验组（zǔ）中验（yàn）证，分（fèn）析（xī）其灵敏度和特异性。并将新建立（lì）的5hmC标志物（wù）基（jī）因组合（hé）的（de）检测性（xìng）能与传统临床变量进行对（duì）比分析（xī）。最后（hòu）对相关（guān）基因进行了信（xìn）号通路分析和功能（néng）探究。

5hmC修饰水平与血（xuè）管并发（fā）症（zhèng）具有相关性

利用逻辑回归模型对62例有并发（fā）症和（hé）无并发症2型糖尿病（bìng）病人的5hmC差异水（shuǐ）平进行分析发现，有并发症（zhèng）2型糖尿病病人（rén）的（de）622个差异修饰（shì）候选基因（yīn）（包括上调（diào）和下调基因）的归（guī）一（yī）化平均数要（yào）明显高于无（wú）并发症的病人（P<0.001），但是（shì）单一并发（fā）症和多（duō）发并发症（zhèng）病人之间没有显（xiǎn）著差异。

之后将有单（dān）一并发症或多种并发症的（de）50例病（bìng）人（rén）用（yòng）逻辑回归模型进行了（le）对（duì）比，发现多种（zhǒng）并发症的病人的153个差异修饰候选基因（包（bāo）括上调和下调基（jī）因）的归一化平均（jun1）数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志（zhì）物可区分有无并发症患者

62例2型糖尿（niào）病病人被随机分成训练（liàn）组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网络筛选后发现（xiàn），16基因-5hmC标志物组合检（jiǎn）测可以用于（yú）区分有（yǒu）并发症和无并发（fā）症的2型糖尿病病人。

基（jī）于（yú）16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分（fèn）析，发现无并发症病人（rén）的分数在训练集和测试集中都明显低于（yú）有并发症的（de）病人。只（zhī）考虑（lǜ）加权平均分的话，受试（shì）者工作特（tè）征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设（shè）置成（chéng）0.5时，在测（cè）试组中中（zhōng）的灵敏度（dù）为（wéi）60%，特异性为100%。

5hmC标（biāo）志物（wù）可区（qū）分病人是单一并发症还是多种并发症

50例有并发症的2型糖尿病病人被随（suí）机分（fèn）成（chéng）训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性网络筛选后（hòu）发现，13基因-5hmC标（biāo）志物组合可以区（qū）分2型糖尿病（bìng）病人（rén）是否发生（shēng）单一（yī）并发症（zhèng）或多种并（bìng）发症（zhèng）。

基于13基因（yīn）组合模型（xíng） (Detection Model 2)， 我们计算（suàn）了单（dān）一并发症和多种并发症（zhèng）的加权平均分，发（fā）现在训练集和测（cè）试集中单一并发症和多种并发症病（bìng）人的分（fèn）数都（dōu）有明显差异（yì）。值（zhí）得（dé）一（yī）提的是，有（yǒu）肾病（bìng）并发症和无肾病并发症病人（rén）的（de）分数也有明显差异。利（lì）用加权平均分作为判断标准（zhǔn）的受试者工作特征曲线（ROC）表明，在测试组中（zhōng）当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与（yǔ）传统临床变量/危险因子（zǐ）的对比

我们评（píng）估了不同临床变（biàn）量/危险因（yīn）子用于监测血管并发（fā）症的灵敏度和特（tè）异性（见表1）。

信（xìn）号（hào）通路分析和功（gōng）能探究

有（yǒu）并发症和无并发症病人的135个差异候选基因的功能（néng）注释分析表（biǎo）明，这些基因主要富（fù）集在一（yī）些经典的信（xìn）号（hào）通路。错误发现率（lǜ）相关P值位于前10%和基（jī）因（yīn）数目≥3的信号通路（lù）包括（kuò）由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的（de）信（xìn）号通路与胰岛（dǎo）素抵抗及炎症反应相关，在血管生物（wù）学和糖尿病发生发展过程中（zhōng）发挥重要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛（fàn）素（sù）C (UBC)，泛素A-52亚基核糖体蛋白融（róng）合产物1(UBA52)]是候选（xuǎn）基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个差异（yì）候选基（jī）因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖（táng）尿病病程相（xiàng）关（guān）的倾（qīng）向，表明5hmC和糖尿病血管并发（fā）症（zhèng）之间可能存（cún）在时间依（yī）赖性的（de）相互作用（yòng）。基于（yú）纵向时间（jiān）队（duì）列的大（dà）样本研究，将（jiāng）可进一步（bù）明确5hmC变化和糖尿病持续时（shí）间之间（jiān）的动态关联（lián）。关于单一（yī）并发症和多种并发症病（bìng）人（rén）的159个候（hòu）选标志基（jī）因的功能（néng）注释研究发（fā）现，存（cún）在细（xì）胞-细胞连接、胶原蛋白形成、新陈代谢、细胞应激应答（dá）信号通（tōng）路的（de）富集，这（zhè）些（xiē）信号通路均与细胞基本功能密切相关。

血管并发症（zhèng）是（shì）三（sān）分之二（èr）糖尿（niào）病病人的（de）死亡原因，若能及（jí）早有效（xiào）控制（zhì）血管（guǎn）并发症的（de）发生，将极大地改善糖尿（niào）病病人的生存（cún）质量（liàng）。该研究建立了一（yī）种利用cfDNA进（jìn）行2型糖尿（niào）病血管并发症监测的无创便捷方法（fǎ），较目前（qián）临床标志物能更准确（què）地（dì）监控血管并发症的发生，从而提示（shì）临床及早采（cǎi）取应（yīng）对措施，有效控（kòng）制病情进展。